Tinklainė yra dinamiškas akies audinys, sudarytas iš daugelio skirtingų tipų ląstelių. St. Jude'o vaikų tyrimų ligoninės mokslininkai naudojo vienos ląstelės sekos nustatymo metodus, kad ištirtų tinklainės ląsteles, vadinamas Müller glia, parodydami, kad šios ląstelės turi unikalų „paklusnumo genų“ rinkinį, kuris yra atviras ir prieinamas genų ekspresijos mechanizmams be ekspresijos.
Darbas taip pat atskleidė, kad šie lankstumo genai leidžia Müller glia greitai iššaukti uždegiminį imuninį atsaką esant stresinėms sąlygoms. Supratimas, kaip tinklainėje sukelia uždegimą, gali padėti kurti būsimus gydymo būdus. Darbas buvo paskelbtas m Vystymosi ląstelė.
Genuose yra nurodymai, kaip gaminti baltymus, kurie organizme naudojami įvairioms funkcijoms atlikti. DNR turintys genai yra patalpinti chromatine, kurį galima atidaryti arba uždaryti, kad būtų galima pasiekti šias instrukcijas.
Vystymosi metu tinklainės progenitorinės ląstelės, visų skirtingų tinklainėje randamų ląstelių tipų pirmtakai, griežtai reguliuoja chromatino atidarymą ir uždarymą, kad būtų užtikrinta ląstelių funkcionavimui reikalingų genų ekspresija. Tinklainės ląstelėms diferencijuojantis, greitam augimui reikalingi genai išjungiami ir supakuojami chromatino viduje.
Tačiau St. Jude komanda pastebėjo atviras chromatino sritis Müller glia ląstelėse, nors genai išilgai tos atviros DNR sekos nėra išreikšti. Tyrėjai šiuos paruoštus, bet laukiančius genus pavadino lankstumo genais, nes jie suteikia Müller glia daugiau lankstumo, kad būtų galima įgyvendinti latentinį epigenetinį programavimą, leidžiantį greitai reaguoti į stresą.
„Jei ląstelė yra veikiama streso, ji gali labai mažai reaguoti, jei dėl uždaro chromatino neturi prieigos prie atitinkamų genų“, – aiškino pirmasis autorius Jackie Norrie, mokslų daktaras, mokslininkas iš Šv. Jude vystymosi neurobiologijos katedra.
„Štai kodėl tinklainei yra palanku turėti ląstelių tipą, pvz., Müller glia, turinčią šiuos sąmoningus atviro chromatino ruožus, taigi ir didesnę galimybę pasiekti ir įjungti genus, reikalingus greitai reaguoti į stresą.”
Atskleidžiant genomo organizavimą
Savo analizei tyrėjai panaudojo grotelių šviesos lakšto (LLS) mikroskopiją. Palyginti su kitais mikroskopijos metodais, kuriuose naudojamas atšiaurus šviesos pluoštas, LLS naudojamas raštuotas šviesos lapas, o tai reiškia, kad ląstelės nepatiria tų pačių įtempių (fototoksiškumo), kokį gali sukelti šviesos pluoštai, ir gali pateikti tikslesnius rezultatus. Ši technika taip pat leidžia tyrėjams pažvelgti į ląsteles kitu kampu, suteikiant tolygų vaizdą iš visų matmenų.
Tyrėjai nustatė reikšmingų skirtumų, kaip skirtingi tinklainės ląstelių tipai organizuoja savo genomą.
„Nors visos jūsų kūno ląstelės turi tą patį pagrindinį žemėlapį, tas pačias pagrindines genetines instrukcijas, ląstelė gali sutvarkyti visą savo genomą labai konkrečiai pagal savo tapatybę ir darbą, kurį ji turi atlikti“, – sakė straipsnio autorė Marybeth Lupo. Ph.D., Sent Džudo raidos neurobiologijos katedros mokslininkas.
Tai leido tyrėjams panaudoti DNR išdėstymą ląstelėse, kad nustatytų ląstelių tipą, nustatant darbo etapą, siekiant suprasti, kaip ir kodėl atsiranda šie genomo architektūros skirtumai.
Vienos ląstelės analizė atrakina Müller glia geno ekspresijos modelius
Tyrėjai susiejo savo mikroskopinį darbą su vienos ląstelės sekos nustatymu. Vertinant tinklainės mėginius, dominuojantis tinklainės ląstelių tipas (strypeliai) užkerta kelią genų ekspresijos signalizacijai ir supainioja analizę. Vienos ląstelės sekos nustatymas, pvz., RNR-seq ir ATAC-seq, leidžia tyrėjams ištirti genų ekspresiją tam tikruose ląstelių tipuose, kad geriau suprastų, kaip tinklainė elgiasi, sąveikauja ir reaguoja į stresą.
„Vienaląstės analizės metodai keičia savo gebėjimą padėti mums visiškai suprasti, kaip skirtingos ląstelių populiacijos veikia vystymosi metu ir streso sąlygomis, pavyzdžiui, traumos ar ligos“, – sakė atitinkamas autorius Michaelas Dyeris, Ph.D., St. Jude'o vystymosi neurobiologijos katedros vedėja.
„Mes daug dirbome, nagrinėdami ląstelių audinių nevienalytiškumą, ir akivaizdu, kad šių metodų panaudojimas leidžia suprasti programavimą, kuris lemia skirtingų ląstelių populiacijų atsaką, kurios gali būti neryškios masiniuose mėginiuose.
Müller glia atlieka įvairias esmines tinklainės funkcijas, padeda palaikyti tinklainės homeostazę. Norėdami suprasti, ką daro Müller glia pastebėti lankstumo genai, tyrėjai savo tinklainės ląstelių mėginius paveikė įvairiomis streso formomis.
Müller glia vaidmens uždegiminiame atsake supratimas
Tyrėjai savo tinklainės mėginius tyrė 15 skirtingų modeliuotų streso sąlygų, imituojančių ligą ar sužalojimą, pavyzdžiui, mėginių šildymą arba vėsinimą, kad atkartotų karščiavimo ar hipotermijos sąlygas, pridėjus gliukozės, kad atkartotų diabetinė retinopatija, arba įvedant mieles, kad sukeltų retinitą. Be to, mokslininkai atkartojo sąlygas, susijusias su akių infekcijomis (pagrindine aklumo priežastimi visame pasaulyje) ir eksitotoksiškumu.
Transkripcijos analizė, reikalinga duomenims interpretuoti, buvo įmanoma bendradarbiaujant su skaičiavimo mokslininkais. „Skaičiavimo metodų derinimas su laboratorijoje atliekamu darbu leidžia mums taikyti integruotą metodą“, – sakė bendraautorė Danielle Little, daktarė, Dyer laboratorijos doktorantė.
„Naudodami tris skirtingus skaičiavimo įrankius, galėjome identifikuoti skirtingas genų grupes, susietas viena su kita, ir bendrai atskirti duomenų rinkinį. Taip galėjome nustatyti transkripcijos veiksnius, kurie yra pagrindiniai ląstelės atsako į stresą reguliatoriai, “ – pridūrė ji.
Daugelis genų, išreikštų reaguojant į įvairius įtempius, buvo susiję su uždegimu, standartine reakcija į ligą ar sužalojimą. Kai tinklainė patiria stresą, Müller glia gali greitai išreikšti savo lankstumo genų signalus per citokinus, kad sukurtų uždegiminį imuninį atsaką. Uždegimas prisideda prie daugelio tinklainės ligų, todėl šis naujas supratimas apie uždegimo sukėlimą yra svarbus kuriant būsimus gydymo metodus.
„Panaudodami vienos ląstelės analizės metodus parodėme, kad unikalus atviras Müller glia chromatinas suteikia jiems galimybę greitai reaguoti į stresą“, – sakė Norrie.
„Ši leistina aplinka greitai citokinų ekspresijai, siekiant įdarbinti uždegiminius veiksnius ir sukelti imuninį atsaką, skatina tinklainės reakciją į ligas ir sužalojimus.”