Vienas iš 10 žmonių visame pasaulyje yra paveiktas retos genetinės ligos, tačiau apie 50 % jų lieka nediagnozuoti, nepaisant spartaus genetinių technologijų ir tyrimų augimo. Net jei žmogus turi galimybę atlikti tyrimus, diagnozės nustatymo procesas gali užtrukti apie penkerius metus ar ilgiau, o tai kartais būna per vėlu pacientams, kurie dažnai būna vaikai, pradėti tinkamą gydymą.
Taip yra iš dalies todėl, kad atliekant dabartinius klinikinius tyrimus naudojamas metodas, vadinamas trumpojo skaitymo sekos nustatymu, kuris negali pasiekti informacijos tam tikruose genomo regionuose ir todėl gali praleisti esminius įrodymus, padedančius nustatyti diagnozę.
Tačiau UC Santa Cruz mokslininkai skatina pažangiausio alternatyvaus metodo, vadinamo ilgai skaitomu sekos nustatymu, tyrimus, kurie gali suteikti išsamesnį duomenų rinkinį, kad būtų galima rasti skirtumus, panaikinti kelių specializuotų testų poreikį ir supaprastinti retų ligų diagnozę.
Naujas tyrimas rodo, kad ilgai skaitoma seka gali pagerinti diagnozės greitį ir sutrumpinti diagnozės nustatymo laiką nuo metų iki kelių dienų – atliekant vieną testą ir už daug mažesnę kainą.
Tyrimas buvo paskelbtas m Amerikos žmogaus genetikos žurnalas ir vadovaujami pagrindiniai UCSC genomikos instituto nariai Biomolekulinės inžinerijos (BME) profesorius Benedict Paten ir BME docentas Karen Miga, taip pat buvęs UCSC podoktorantas Jeanas Monlongas.
„Retas ligas žmonės stengėsi diagnozuoti tiek daug metų, ir jei turėsime sekos nustatymo technologiją, kuri supaprastintų diagnostinį tyrimą, manau, kad tai bus didžiulis indėlis – būtent tai mes išbandėme šiame dokumente. “, – sakė Shloka Negi, UC Santa Cruz BME Ph.D. studentas, pirmasis šio straipsnio autorius.
„Šiandien genetinės sekos diagnostikos derlius yra varginantis mažas“, – sakė Patenas. „Viena iš galimų priežasčių yra neišsamūs klinikinėje praktikoje naudojami sekos nustatymo metodai. Šiame darbe mes tikriname hipotezę, kad naujas, išsamesnis ilgai skaitomas sekos nustatymas gali sukurti papildomos informacijos, naudingos genetinei diagnozei.
„Džiaugiamės, kad mūsų grupėje atradome daugybę papildomų potencialiai įdomių genetinių variantų ir epigenetinių signalų. Nors tai dar ankstyvos dienos, ši informacija yra daug žadanti, ir prireiks laiko, kol bendruomenė supras ir supras didžiąją dalį šios informacijos. nauja informacija“.
Retos ligos radimas
Šiame tyrime daugiausia dėmesio buvo skiriama retoms monogeninėms ligoms, kurias sukelia vieno geno sutrikimas.
Mokslininkai genetines ligas diagnozuoja ieškodami savo genetinėje medžiagoje, kad surastų variantus – geno skirtumus, kurie gali trukdyti jam tinkamai veikti. Įprastu būdu šiems variantams rasti naudojamas metodas, vadinamas trumpojo skaitymo sekos nustatymu, kuris nuskaito genetines bazių poras – adenino (A), citozino (C), guanino (G) ir timino (T) derinius – maždaug sekomis. 150-250 vienu metu.
Tačiau trumpo skaitymo sekos apribojimas yra tas, kad tam tikruose genomo regionuose ji gali praleisti svarbią informaciją, pavyzdžiui, bazinių porų modelius, kurie yra daug ilgesni nei tik 250 bazinių porų. Ji taip pat negali atlikti „fazavimo“ – proceso, kuriuo nustatoma, kurie variantai paveldėti iš motinos, o kurie – iš tėvo.
Tai gali padėti gydytojams išsiaiškinti, iš ko paveldimi variantai; pavyzdžiui, jei du variantai yra paveldėti iš to paties tėvo, po vieną iš kiekvieno iš tėvų arba nepaveldėti iš viso. Tai gali būti labai naudinga informacija genetinėms diagnozėms nustatyti, ypač kai nėra duomenų apie tėvus.
Priešingai, ilgai skaitoma seka gali vienu metu nuskaityti ilgus DNR ruožus, pašalinant spragas, dėl kurių mokslininkai ir gydytojai gali praleisti svarbią informaciją apie genų variaciją. Ilgai skaitoma seka taip pat suteikia tiesioginius etapų duomenis, taip pat informaciją apie metilinimą – cheminį DNR procesą, dėl kurio genai „įjungiami arba išjungiami“ ir gali prisidėti prie ligų.
„Ilgai skaityta seka tam tikrais atvejais bus daug geresnė, ir mes imamės veiksmų tai įrodyti”, – sakė Negi.
Pirmaujantis metodų srityje
UC Santa Cruz genomikos instituto mokslininkai turi turtingą naujovių istoriją ir patirtį seniai skaityto sekos nustatymo srityje ir aktyviai kuria metodus, skirtus optimizuoti sekos nustatymą ir analizę įvairioms sveikatos tyrimų programoms. Daugelis metodų, kuriuos mokslininkai sukūrė siekdami žygdarbių, pavyzdžiui, pirmasis tikrai pilnas etaloninis genomas nuo telomero iki telomero, dabar yra naudojami siekiant pagerinti pacientų rezultatus.
„Sustiprinę ankstesnes išvadas, mes nustatėme, kad ilgai skaitomos sekos naudojimo pranašumai žymiai padidėjo, kai vietoj esamos neišsamios, bet plačiai naudojamos genominės nuorodos buvo naudojamas pilnas, vadinamasis „telomeras-telomeras“ etaloninis genomas“, – sakė Miga. pasakė.
„Tikimės, kad pangenomos – nuorodos, atspindinčios įvairias žmonių variacijas – gaus dar daugiau naudos iš naujų, ilgai skaitytų sekos nustatymo technologijų.
Pateno ir Migos laboratorijos bendradarbiavo su gydytojais, siekdamos dirbti su 42 retomis ligomis sergančių pacientų atvejais – kai kurie iš jų buvo diagnozuoti naudojant trumpo skaitymo metodus ar kitus specializuotus tyrimus, o kai kurie iš jų vis dar nebuvo diagnozuoti. Kai kuriais atvejais mokslininkai turėjo prieigą prie tėvų genetinės informacijos, o kitais – ne.
Ilgai skaitytam pacientų sekos nustatymui vadovavo „Miga Lab“, naudodama nanoporų sekos nustatymą – ilgą skaitymo sekos nustatymo metodą, pradėtą UCSC, kad būtų pasiektas labai tikslus, nuo galo iki galo nuskaitytas pacientų genomas už maždaug 1000 USD už mėginį.
Genominiai duomenys buvo analizuojami naudojant skaičiavimo metodus, sukurtus Pateno laboratorijoje, siekiant rasti mažus ir didelius variantus, fazės duomenis ir metilinimo duomenis, naudojant vieną dujotiekį, vadinamą Napu vamzdynu. Analizės procesas trunka apie dieną ar mažiau, priklausomai nuo kompiuterio apdorojimo greičio, ir kainuoja 100 USD.
Bylų sprendimas
Atlikę pacientų duomenų seką ir išanalizavimą, mokslininkai nustatė, kad ilgas skaitymas suteikė išsamesnį duomenų rinkinį, palyginti su tuo, ką galima gauti naudojant trumpo skaitymo seką.
Ilgai perskaityta seka nustatė galutinę diagnozę 11 iš 42 kohortos pacientų, pateikiant viską, kas buvo žinoma iš trumpai nuskaitytų duomenų, taip pat papildomos informacijos, įskaitant papildomus retus kandidatų variantus, ilgo nuotolio fazavimą ir metilinimą. vienas, ekonomiškas ir greitas protokolas.
Iš 11 diagnozuotų atvejų buvo keturi įgimta antinksčių hipoplazija (reta būklė, kai antinksčiai yra išsiplėtę ir netinkamai funkcionuoja). Už šią ligą atsakingas genas yra ypač sudėtingame genomo regione – jo negalima apibūdinti naudojant trumpo skaitymo sekos nustatymo technologiją, o dabartinis klinikinis tyrimas yra sudėtingas ir neišsamus.
„Siekdami išspręsti šiuos atvejus, sukūrėme naują pangenominį įrankį, kuris integruoja naujus aukštos kokybės mazgus, tokius kaip etaloninis genomas nuo telomero iki telomero“, – sakė Monlongas, pradėjęs šį projektą kaip doktorantas Pateno laboratorijoje ir tęsęs savo darbą. dabartinės pareigos INSERM Prancūzijoje.
„Džiaugiamės galėdami rasti ir nustatyti visų keturių mūsų kohortos pacientų, sergančių šia liga, patogeninius variantus. Ateityje tai gali pasiūlyti greitą ir išsamų klinikinį tyrimą. Žinome, kad daugelis retų ligų yra susijusios su žmogaus genomą, kurį istoriškai buvo sunku ištirti, todėl mūsų rezultatai skatina mus išplėsti savo požiūrį į daugiau tų ligų, kurios ilgą laiką buvo sustojusios.
Be to, du atvejai buvo susiję su lytinio vystymosi sutrikimais, o vienas retas Leydig ląstelių hipoplazijos atvejis paveikė vyrų lytinį vystymąsi dėl nepakankamai išsivysčiusių Leydig ląstelių sėklidėse. Be to, galiausiai buvo išspręsti keturi neurologinio vystymosi sutrikimų atvejai, kurių kiekvienas yra ilgas ir sudėtingas diagnostinis odisėjas.
„Tikėtina, kad ilgo skaitymo sekos nustatymas yra kitas geriausias neišspręstų atvejų testas, kai yra įtikinami vieno geno variantai arba aiškus fenotipas“, – sakė Negi. „Tai gali būti vienas diagnostinis testas, sumažinantis kelių klinikinių vizitų poreikį ir paversdamas metus trunkančią diagnostinę kelionę į kelias valandas.”
Vidutiniškai kiekvienas pacientas turėjo 280 genų (įskaitant kai kuriuos Mendelio ligos genus, kurie yra susiję su paveldimais sutrikimais, kuriuos sukelia vieno geno mutacijos) su reikšmingomis baltymus koduojančiomis sritimis, kurios buvo unikaliai padengtos ilgais skaitymais ir neaptiktos trumpais skaitymais.
„Yra tiek daug daugiau genomo, kad ilgas skaitymas gali atrakinti“, – sakė Negi. „Tačiau užtruks šiek tiek laiko, kol galėsime visiškai interpretuoti šią naują informaciją, atskleistą ilgais skaitymais. Šių duomenų nebuvo mūsų klinikinėse duomenų bazėse, kurios buvo sukurtos naudojant trumpo skaitymo analizę ir susiejimą su standartine nuoroda.
„Mes parodėme, kad ilgo skaitymo metu atskleidžiama apie 5,8 % daugiau telomerų iki telomerų genomo, kurio trumpas skaitymas tiesiog negalėjo pasiekti.
Kiti UC Santa Cruz mokslininkai, dalyvaujantys šiame tyrime, yra Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker ir Sara O'Rourke.