Nepaisant plaukimo skirtinguose pasauliuose, žuvys ir žmonės yra biologiškai daug arčiau, nei galima pamanyti. Pasinaudoję šia giminyste, tyrėjai dabar naudojo zebrafish embrionus, kad sugalvotų naują perspektyvią Kaposiformos limfangiomatozės (KLA) terapiją-retą, gyvybei pavojingą limfinės sistemos genetinį sutrikimą.
Tyrime, paskelbtame Eksperimentinės medicinos žurnalasWeizmanno mokslo instituto mokslininkai kartu su Šebos medicinos centro gydytojais nustatė du vaistus, turinčius galimybę gydyti KLA, dėl kurių šiuo metu nėra vaistų.
Bendras projektas prasidėjo, kai devynerių metų berniukas atvyko į prof. Shoshana Greenberger kliniką Šebos „Safra“ vaikų ligoninėje su sunkiu dusulumu ir jam buvo diagnozuota KLA. Siekdamas pagilinti jų supratimą apie ligą, Greenbergeris kreipėsi į prof. Karina Yaniv iš Weizmann imunologijos ir regeneracinės biologijos skyriaus, kuris daugiau nei du dešimtmečius tyrinėjo, kaip susidaro kraujo ir limfiniai indai, naudojant zebrafish modelius.
KLA limfinės kraujagyslės tampa neįprastai padidintos ir iškraipytos, o tai neleidžia limfos sistemai tinkamai atlikti savo darbą: skysčio nutekėjimas iš audinių ir palaiko daugybę būtinų kūno funkcijų.
Kaip ir Greenbergerio gydomo berniuko atveju, tai, kas paprastai pritraukia jaunus pacientus gydytojui, sunku kvėpuoti dėl skysčių kaupimosi krūtinėje, tačiau liga taip pat veikia odą ir daugybę kitų organų.
Ankstesniame Greenbergerio vadovaujamame darbe jos komanda Sheba atsekė ligą į vieną geno, vadinamo NRAS, mutaciją, vadinamą onkogenu.
Gydytojai visame pasaulyje pradėjo gydyti pacientus, sergančius tam tikrus vėžio vaistus, kurie blokuoja NRA ar jo partnerius, tačiau šie vaistai ne visada yra pakankamai veiksmingi ir jie turi atšiaurią šalutinį poveikį. Jiems nepavyko išgelbėti Greenbergerio paciento gyvybės, tačiau berniuko ląstelės tapo KLA mechanizmų tyrimų pagrindu.
„Mes norėjome būti tikri, kad mūsų nustatyta mutacija iš tikrųjų sukelia KLA ir išmokti, kaip tai daro, tikėdamiesi rasti geresnę terapiją“, – sako Greenbergeris, vadovaujantis daugiadalykio kraujagyslių anomalijų centrui Sheba. „Būtent tai paskatino mus bendradarbiauti su Weizmannu.”
Šio tyrimo metu zebrafish tapo galingais sąjungininkais ne tik todėl, kad jų embrionai yra skaidrūs ir greitai vystosi, bet ir todėl, kad jų limfinės sistemos turi daugybę stebėtinai daug bruožų su žmonėmis, pradedant nuo genetikos iki anatomijos.
Projektas, kuriam vadovauja Greenbergeris ir Yanivas, vadovaujamas ir vadovaujamas daktaro Ivano Bassi, podoktorantūros bendradarbio Yaniv'o laboratorijoje, pradėjo kurti zebrafish žmogaus ligos modelį. Šį modelį iš pradžių patvirtino Amani Jabali, MSC studentas, kurį prižiūrėjo Greenbergeris ir Yaniv.
Kadangi žmogaus NRAS genas yra maždaug 80% identiškas zebrafish versijai ir suaktyvina panašius biocheminius kelius, tyrėjai sugebėjo įterpti mutavusį žmogaus geną, paimtą iš Greenbergerio paciento ląstelių, į mažus zebrafish embrionus.
Iššūkis buvo užtikrinti, kad mutavęs genas būtų išreikštas vien limfinėse kraujagyslėse, kaip ir žmogaus ligos, ir niekur kitur organizme. Kai tai buvo pasiekta, embrionams atsirado limfinių anomalijų, kurios labai primena pacientų panašumą į žmones.
„Tai buvo nuostabi akimirka“, – prisimena Yaniv. „Tiesiog pažvelgęs į šiuos mutantų embrionus žinojau, kad einame teisingu keliu.”
Pagrindinis embrionų limfinis indas tapo labai iškraipytas, todėl jų širdys išsiplėtė ir balionas. Tolesnis tyrimas patvirtino, kad šie embrionai dalijosi pagrindinėmis savybėmis su žmogaus KLA sergančiais pacientais, įskaitant išsiplėtusius limfinius indus ir patinimą aplink širdį.
Naudodamiesi jų modeliu, Bassi ir kolegos iššifravo anksčiau nežinomus ligos mechanizmo aspektus. Sveikose ląstelėse NRAS suaktyvina ląstelių dalijimąsi tik tada, kai aktyvinamas signalu. KLA mutavusi NRA įstrigo „įjungtoje“ padėtyje, todėl limfinės ląstelės dalijasi ir nekontroliuojamai auga.
Užsikabinęs ant atradimo
Kitas kritinis žingsnis buvo rasti mažą molekulę, kuri galėtų blokuoti ligą sukeliančios mutacijos poveikį. Zebrafish embrionai puikiai tiko šiai užduočiai, nes jie leido išbandyti potencialius vaistus gyvame organizme, o ne tik išskirtuose baltymuose ar ląstelėse. Bet jie taip pat sukėlė didelį galvos skausmą.
Didelio pralaidumo atranka, standartinis metodas greitai išbandyti daugybę junginių, paprastai yra automatizuotas. Sudėtinga dalis buvo išsiaiškinti, kaip kiekvienas zebrafish patekti į tiksliai tinkamą vietą mikroskopu – nepadarant rankomis – taip, kad mašina galėtų užfiksuoti nuoseklius vaizdus ir įvertinti procedūrų poveikį.
Bendradarbiaudama su bendradarbiais, komanda suprojektavo protingą automatizuotą sistemą, kurioje kiekvienas embrionas buvo švelniai numestas į tiksliai pritaikytą plyšį po mikroskopu, kur jis buvo nufotografuotas.
Tada AI pagrįstas algoritmas apibūdino visą lervų žuvies kūną ir išmatuojo jo plotą po kiekvieno vaisto. Kadangi mutantinės žuvys turėjo padidėjusias širdis, jų bendras kūno plotas buvo žymiai didesnis nei įprasta, todėl tikimasi, kad po gydymo veiksmingu vaistu sumažės poveikis.
Naudodama šią sąranką, komanda apžiūrėjo apie 150 mažų molekulių, visi jos esami vaistai, jau patvirtinti kitoms reikmėms. Apie 30 parodė perspektyvų poveikį; Galų gale buvo išrinkti du geriausi kandidatai.
Abu šie vaistai pakeitė į KLA panašius simptomus zebrafish modelyje: balioninė širdis ir pagrindinis limfinis laivas susitraukė į normalų dydį ir formą.
Norėdami patikrinti, ar šie vaistai gali padėti gydyti žmogaus ligą, „Sheba“ komanda juos pritaikė limfinėse ląstelėse iš Greenbergerio KLA paciento. Du junginiai turėjo ryškų poveikį, blokuodami ląstelių nenormalų daigumą, ligos požymį. Svarbu tai, kad abu vaistai turi geresnį saugos profilį, nei gydytojai, gydantys gydytojai, gydo KLA, tai reiškia, kad jie gali sukelti mažiau šalutinio poveikio.
„Tikimės, kad netrukus bus pradėtas klinikinis tyrimas, skirtas įvertinti šiuos vaistus pacientams“, – sako Greenbergeris. „Kadangi KLA yra reta liga, mes stengsimės sukurti daugiacentrinį bendradarbiavimą, kad suburtų pakankamai dalyvių.”
Tuo tarpu „Yaniv“ laboratorija naudoja zebrafish modelius, norėdama ištirti kitus limfinius sutrikimus ir toliau tirti KLA. Vienas klausimas juos vis dar glumina: kodėl NRAS mutacija smarkiai pažeidžia limfinius indus, tačiau palieka venas ir arterijas nepaliestas? Išsprendus šią paslaptį, tai gali sukelti visiškai naujas terapines strategijas.
„Tai yra ilgalaikiai klausimai,-sako Yanivas,-tačiau tai, ką mes nustatėme šiame tyrime, galėtų padėti pacientams daug greičiau. Kadangi mūsų identifikuoti vaistai jau yra patvirtinti, todėl jie pakartotinai pakartotinai gali judėti daug greičiau nei nuo nulio.”