Žmogaus genomą sudaro maždaug 3 milijardai bazinių porų, o visi žmonės yra 99,6% identiški pagal savo genetinę sandarą. Tas mažas 0,4% lemia bet kokį skirtumą tarp vieno ir kito asmens. Konkretūs šių bazinių porų mutacijų deriniai turi svarbių užuominų apie sudėtingų sveikatos problemų, įskaitant širdies ligas ir neurodegeneracines ligas, tokias kaip šizofrenija, priežastis.
Dabartiniai gyvų ląstelių mutacijų modeliavimo ar koregavimo metodai yra neveiksmingi, ypač kai atliekamas multipleksavimas – vienu metu genome įdiegiamos kelios taškinės mutacijos. Mokslininkai iš Kalifornijos universiteto San Diego sukūrė naujus, efektyvius genomo redagavimo įrankius, vadinamus multipleksuotais ortogoniniais bazių redaktoriais (MOBE), kad vienu metu įdiegtų kelias taškines mutacijas.
Jų darbas, vadovaujamas chemijos ir biochemijos docento Alexis Komor laboratorijos, pasirodo Gamtos biotechnologija.
Komoro komanda buvo ypač suinteresuota palyginti genomus, kurie skiriasi viena raide DNR. Šios raidės – C (citozinas), T (timinas), G (guaninas), A (adenozinas) – žinomos kaip bazės. Jei vienas asmuo turi C bazę, kitas asmuo gali turėti T bazę. Tai yra vieno nukleotido variantai (SNV) arba vieno taško mutacijos. Žmogus gali turėti 4–5 milijonus variantų. Kai kurie variantai yra nekenksmingi; kai kurie yra kenksmingi; ir dažnai tai yra variantų derinys, kuris sukelia ligą.
Viena problema, susijusi su genomo naudojimu ligų modeliavime, yra daugybė galimų variantų. Jei mokslininkai bandytų nustatyti, kurios genetinės mutacijos buvo atsakingos už širdies ligas, jie galėtų iššifruoti kohortos, kurios visos sirgo širdies liga, genomus, tačiau dėl bet kurių dviejų žmonių variacijų skaičiaus labai sunku nustatyti, kuris variacijų derinys sukelia liga.
„Kyla problemų interpretuojant genetinius variantus. Tiesą sakant, dauguma nustatytų variantų yra neklasifikuojami kliniškai, todėl net nežinome, ar jie yra patogeniški, ar gerybiniai”, – teigė neseniai daktaras Quinnas T. Cowanas. baigė universiteto Chemijos ir biochemijos katedrą ir pirmasis šio straipsnio autorius.
„Mūsų tikslas buvo sukurti įrankį, kurį būtų galima naudoti modeliuojant ligas, įdiegiant kelis variantus kontroliuojamoje laboratorijoje, kur juos būtų galima toliau tirti.
Genų redagavimo evoliucija
Norėdami suprasti, kodėl buvo sukurti MOBE, turime suprasti tradicinio genų redagavimo įrankio CRISPR-Cas9 apribojimus. CRISPR-Cas9 naudoja kreipiamąją RNR, kuri veikia kaip GPS signalas, kuris eina tiesiai į genominę vietą, kurią norite redaguoti. Cas9 yra DNR surišantis fermentas, kuris perpjauna abi DNR grandines, todėl visiškai nutrūksta.
Nors ir gana paprasta, dvigubos grandinės pertraukos gali būti toksiškos ląstelėms. Toks genų redagavimas taip pat gali sukelti indelius – atsitiktinius įterpimus ir ištrynimus – kai ląstelė negali tobulai pasitaisyti. Kelių genų redagavimas CRISPR-Cas9 padidina riziką.
Vietoj CRISPR Komoro laboratorija naudoja jos sukurtą bazės redagavimo techniką, kuri atlieka cheminį DNR pakeitimą, nors vienu metu galima atlikti tik vieno tipo redagavimą (pavyzdžiui, nuo C iki T arba A į G). Taigi, o ne žirklės, kurios vienu metu išpjauna visą atkarpą, bazinis redagavimas ištrina ir pakeičia vieną raidę vienu metu. Jis yra lėtesnis, bet efektyvesnis ir mažiau kenksmingas ląstelėms.
Vienu metu taikant du ar daugiau bazinių redaktorių (keičiant C į T vienoje vietoje, o A į G kitoje genomo vietoje), galima geriau modeliuoti poligenines ligas – tas, kurios atsiranda dėl daugiau nei vieno genetinio varianto. Tačiau neegzistavo technologija, kuri galėtų tai padaryti efektyviai be vadovaujančios RNR „kryžiavimo“, kuri atsitinka, kai baziniai redaktoriai atlieka nepageidaujamus pakeitimus.
Cowan MOBE naudoja RNR struktūras, vadinamas aptamerais – mažomis RNR kilpomis, kurios jungiasi su specifiniais baltymais, kad įdarbintų bazę modifikuojančius fermentus į konkrečias genomo vietas, leidžiančias vienu metu redaguoti kelias vietas su dideliu efektyvumu ir mažesniu skersinio pokalbio dažniu.
Ši sistema yra nauja ir tai yra pirmas kartas, kai kas nors panaudojo aptamerius, kad įdarbintų ABE (adenozino bazės redaktorius) kartu su CBE (citozino bazės redaktoriais) stačiakampiu modeliu, kad sukurtų MOBE.
Skirtumai ryškūs: kai CBE ir ABE pateikiami kartu, nenaudojant MOBE, perkalbėjimas įvyksta iki 30 % laiko. Naudojant MOBE, skersinis pokalbis yra mažesnis nei 5%, o norimų bazinių pakeitimų konversijos efektyvumas pasiekiamas 30%.
Tyrimas buvo principo įrodymas MOBE sistemos, kuriai buvo suteiktas laikinas patentas, įgyvendinamumą. Norėdami juos dar labiau išbandyti, komanda atliko keletą atvejų, susijusių su tikromis ligomis, įskaitant Kallmann sindromą, retą hormoninį sutrikimą. Jų eksperimentai atskleidė, kad MOBE sistemos gali būti naudojamos efektyviai redaguoti atitinkamas tam tikrų poligeninių ligų ląstelių linijas.
„Mes šiuo metu dedame plazmides į AddGene, kad kiekvienas galėtų jas laisvai pasiekti. Tikimės, kad kiti tyrėjai naudos MOBE genetinėms ligoms modeliuoti, sužinos, kaip jos pasireiškia, ir, tikėkimės, sukurs veiksmingus gydymo būdus”, – sakė Cowan. .
Pilnas autorių sąrašas yra Quinn T. Cowan, Sifeng Gu, Wanjun Gu, Brodie L. Ranzau, Tatum S. Simonson ir Alexis C. Komor (visi UC San Diego).