Holografinė optogenetika leistų greičiau nustatyti smegenų žemėlapius naujiems atradimams

Naujausios technologinės pažangos atvėrė naujas galimybes neurologijos tyrimams, leidžiančius mokslininkams vis tiksliau nustatyti smegenų struktūrą ir sinaptinį ryšį (ty jungtis, per kurias neuronai bendrauja tarpusavyje).

Nepaisant šių pokyčių, plačiausiai naudojami sinapsinio ryšio vaizdavimo metodai yra lėti ir nesugeba tiksliai užregistruoti ryšių tarp neuronų pokyčių in vivo, arba, kitaip tariant, kol gyvūnai yra budrūs ir užsiima specifine veikla.

Dvi skirtingos tyrimų grupės, viena įsikūrusi Kolumbijos universitete ir UC Berkeley, o kita – Sorbonos universiteto Regėjimo institute Paryžiuje, pristatė daug žadantį sinapsių tyrimo metodą in vivo. Jų siūlomos kartografavimo strategijos, išdėstytos dviejose dalyse Gamtos neuromokslai straipsniais, derina holografinę optogenetiką – metodą, skirtą selektyviai ir tiksliai stimuliuoti arba nutildyti specifines neuronų populiacijas, su skaičiavimo metodais.

„Šis projektas buvo tikrai jaudinantis Kolumbijos ir UC Berkeley laboratorijų Paninski ir Adesnik bendradarbiavimas, kurio tikslas buvo sukurti labai reikalingas priemones, skirtas nustatyti, kaip smegenų neuronai yra sujungti tarpusavyje“, – „Medical Xpress“ sakė Marcusas A. Triplettas, pirmojo straipsnio autorius.

„Svarbu suprasti, kaip prijungta nervų sistema, nes šie laidai yra didelė smegenų grandinės funkcijos dalis.

Per pastaruosius kelerius metus daugelis neurologų bandė nustatyti dideles smegenų audinio dalis naudodami elektronų mikroskopijos metodą. Tai įrankis, kuris naudoja taikomus elektronų pluoštus, kad gautų labai detalius biologinių mėginių vaizdus, ​​​​kurie gali atskleisti žymiai mažesnes smegenų struktūras nei įprasti šviesa pagrįsti vaizdavimo metodai.

„Nors šios įmonės buvo labai sėkmingos, jos suteikia ribotą informacijos tipą, nes nustato ryšius fiksuotame (negyvame) audinyje“, – sakė Triplettas.

„Mes norėjome sukurti metodą, kuris turėtų potencialą nustatyti didelius kiekius, tačiau taip pat galėtų tiesiogiai išmatuoti svarbiausius biofizinius kintamuosius, pvz., Neuronų jungčių, kurios yra tik gyvuose audiniuose, stiprumą.”

Triplettas ir jo kolegos iš Kolumbijos ir UC Berkeley, siekdami ištirti, ar smegenų plyšiuose yra sinaptinių jungčių, naudojo techniką, vadinamą holografine optogenetika, kuri naudoja šviesą tam, kad suaktyvintų specifinius neuronų rinkinius, kur jie įvedė šviesai jautrius baltymus, vadinamus opsinais.

Užfiksuodami vieno neurono elektrinį aktyvumą ir imituodami kitą naudodami optogenetinius įrankius, neurologai gali ištirti ryšį tarp dviejų neuronų. Jei du neuronai yra sujungti sinapse, jie stebėtų nervinio aktyvumo perdavimą, o tai iš esmės reiškia, kad vienas neuronas sukels aktyvumą kitame.

„Mūsų naujovė šiame tyrime buvo sukurti naują skaičiavimo metodą, apjungiantį du svarbius taikomosios matematikos metodus – būtent gilų mokymąsi ir suspaustą jutimą“, – aiškino Triplettas. „Šie metodai įgalina optogenetinį metodą nustatyti ryšius tarp neuronų daug greičiau nei ankstesni metodai.”

Triplettas ir jo kolegos įvertino savo holografinės optogenetikos technikos galimybes atlikdami daugybę bandymų ir jų rezultatai buvo labai perspektyvūs. Tiesą sakant, jie nustatė, kad jų metodas gali nustatyti 10 kartų didesnį jungčių skaičių nei anksčiau įdiegtų metodų skaičius per tą patį laikotarpį.

„Manau, kad mūsų technika bus labiausiai naudojama tiriant neuroninį skaičiavimą, ty atrandant, kaip smegenų laidai suteikia puikių skaičiavimo gebėjimų“, – sakė Triplettas. „Mūsų metodas taip pat gali turėti svarbių pasekmių suprasti ligos etiologiją, nes neurologiniai sutrikimai gali būti siejami su nenormaliu sinapsiniu ryšiu.

Maždaug tuo pačiu metu, kaip Triplettas ir jo kolegos, Sorbonos universiteto „Wavefront Engineering Microscopy komanda“ taip pat pradėjo tyrinėti holografinės optogenetikos, kaip priemonės, leidžiančios tiksliai kontroliuoti neuronų veiklą ir nustatyti ryšius tarp jų, potencialą. Jų darbas paskatino įvesti įvairius pažangiausius optinius įrankius smegenų struktūrai ir sinapsiniam ryšiui tirti.

„Mūsų komanda, jungianti fizikos, optinės inžinerijos ir neurobiologijos žinias, buvo viena iš pionierių kuriant pažangius optinius metodus, siekiant visapusiškai pasinaudoti šiomis galimybėmis“, – „Medical Xpress“ sakė Dimitrii Tanese, antrojo dokumento bendraautorius.

„Mes pristatėme metodus, kaip tiksliai formuoti šviesą erdvėje ir laike, leidžiančius mums neinvaziškai nukreipti ir manipuliuoti neuronų veikla gyvose smegenyse.”

Išbandę įvairių optogenetinių metodų veiksmingumą neurologijos tyrimams ir pritaikę juos savo tyrimuose, Tanese ir jo kolegos pradėjo ieškoti naujo požiūrio, kuris įveiktų jų ribotumą. Konkrečiai, jie suprato, kad esami metodai buvo neveiksmingi nustatant ryšius tarp neuronų in vivo ir realiu laiku.

„Supratimas, kaip atskiri neuronai yra sujungti funkcinėse, gyvose smegenyse, dažnai laikomas šventuoju neurologijos graliu, nes tai gali atskleisti, kaip tinklo struktūra yra susijusi su funkcija, kaip smegenys persitvarko per plastiškumą ir kaip atsigauna po sužalojimo“, – sakė Tanese.

„Mes siekėme išnaudoti optogenetikos atvertas galimybes, įveikti esamus apribojimus ir sukurti bei patvirtinti keičiamo dydžio, kiekybinę sistemą, skirtą sinaptinių jungčių atvaizdavimui tiesiogiai nepažeistose smegenyse dideliu tikslumu ir greičiu.”

Norėdami nustatyti ryšius tarp neuronų, mokslininkai turi sugebėti generuoti elektrinius signalus ir stebėti, kaip jie sklinda per sinapses, jungiančias neuronų poras. Įprasti metodai, pagrįsti elektrodų implantavimu smegenų audinyje, yra invaziniai ir negali vienu metu ištirti kelių jungčių.

„Mūsų tikslas yra išnaudoti mažą šviesos invaziškumą, lankstumą ir tikslumą, kad paspartintume šį procesą“, – paaiškino Tanese.

„Konkrečiai, mes naudojome optinę technologiją, vadinamą dviejų fotonų holografine stimuliacija, kuri leidžia mums savo nuožiūra pakeisti šviesą ir tiksliai nukreipti į konkrečias dominančias ląsteles. Kartu su šviesai jautrių baltymų (opsinų) genetine išraiška, ši technika leidžia tiksliai tiksliai „apšviesti” atskirus neuronus giliai smegenyse, pavyzdžiui, selektyviai paspaudžiant tris mygtukus.

Selektyviai aktyvuodami neuroną smegenyse, tyrėjai užfiksavo kito neurono elektrinį aktyvumą, kad nustatytų, ar jis gavo signalą, o tai savo ruožtu rodytų sinapsinio ryšio buvimą. Kadangi šie ryšiai yra gana reti, neuronų tikrinimas po vieną yra labai neefektyvus ir atima daug laiko.

„Siekdami įveikti šį apribojimą, ištyrėme holografinės šviesos formavimo universalumą, leidžiantį vienu metu suaktyvinti kelis neuronus, atlikdami tam tikrą grupinio testavimo formą ir, bendradarbiaudami su Oweiss komanda (Floridos universitetas), sujungėme jį su skaičiavimo algoritmais, atkuriančiais, kurie neuronai iš tikrųjų yra sujungti“, – sakė Tanese.

„Naudodami savo metodą, per penkias minutes ir vienu eksperimentu galėtume nustatyti iki 100 presinapsinių neuronų nepažeistose pelės smegenyse, o tai reiškia, kad pagerėjo ankstesni metodai.”

Panašiai kaip Triplett ir jo kolegų naudojama technika, šios tyrimo grupės sukurtas eksperimentinis metodas remiasi įvairiomis sritimis, įskaitant neuromokslą, elektrofiziologiją, genetiką, optiką ir signalų analizę.

Vykdydami tyrimą Tanese ir jo bendradarbiai pademonstravo savo technikos potencialą, panaudodami jį gyvų pelių smegenų sinapsėms nustatyti.

„Suderinus greitį, tikslumą ir mastelį, mūsų požiūris įveikia pagrindinius tradicinių elektrofiziologinių metodų apribojimus ir atveria naujas galimybes tirti, kaip gyvose smegenyse organizuojamos neuroninės grandinės“, – sakė Tanese.

„Manome, kad ilgalaikėje perspektyvoje ši sistema padės sukurti labiau integruotą supratimą apie tai, kaip neuronų tinklai palaiko suvokimą, prisitaikymą ir pažinimą, sumažindami atotrūkį tarp sinapsinių mechanizmų, tinklo struktūros ir smegenų funkcijos.”

Apskritai, nauji holografinės optogenetikos metodai, kuriuos sukūrė šios dvi tyrėjų komandos, netrukus gali atverti naujas įdomias galimybes neurologijos tyrimams. Tanese ir jo kolegos dabar bando patobulinti savo požiūrį, pavyzdžiui, integruodami įtampos indikatorių, fluorescencinių molekulių, kurios gali užfiksuoti nedidelius neuronų elektrinio potencialo pokyčius, naudojimą.

„Dabar, kai šie jutikliai tampa pakankamai jautrūs, kad aptiktų tokius subtilius signalus kaip atskiri sinapsiniai įėjimai, mes galėsime pašalinti iš mūsų eksperimentų paskutinį likusį elektrodą ir pasiekti tai, ką galima apibrėžti kaip visiškai optinį sinaptinį atvaizdavimą“, – pridūrė Tanese.

„Taikant tokią strategiją, šviesa būtų naudojama tiek neuronams suaktyvinti, tiek jų kaimynų atsakams stebėti. Ši pažanga labai sumažintų invaziškumą ir dar labiau padidintų pralaidumą, atveriant kelią didelio masto grandinių žemėlapiams ir išilginiams tyrimams, kurie seka ryšio pokyčius bėgant laikui mokymosi, patirties ar ligos progresavimo metu.

Kita Kolumbijos ir UC Berkeley tyrimų grupė dabar taip pat atlieka tolesnius tyrimus, kuriais siekiama pagerinti savo požiūrį ir naudoti jį sinapsėms tam tikruose smegenų regionuose nustatyti.

„Kalbant apie eksperimentinę dalykų pusę, mes tikrai džiaugiamės galėdami panaudoti šias priemones, kad geriau suprastume smegenų grandinę, kuri yra regėjimo suvokimo pagrindas“, – sakė Triplettas.

„Kalbant apie skaičiavimus, planuojame ir toliau didinti savo metodų mastelį, kad kuo greičiau atvaizduotume didesnes neuronų populiacijas. Viename kubiniame pelės smegenų milimetre, priklausomai nuo smegenų srities, yra nuo dešimčių iki šimtų tūkstančių neuronų, ir net vienas iš tų neuronų gali sukurti tūkstančius sinapsinių jungčių smegenyse, todėl reikia daug dirbti!”