Sveikos T ląstelės yra subalansuotos imuninės sistemos pagrindas. Jie gali pradėti kovoti su infekcijomis ar vėžiu, tačiau nesuaktyvėja taip, kad pakenktų ląstelėms, kurias jie turi apsaugoti, kaip tai daroma autoimuninių ligų atveju.
Užkulisiuose šį kruopštų balansavimo veiksmą organizuoja genų trijulė. Yra žinoma, kad šie genai, žinomi kaip CD28, CTLA4 ir ICOS, atlieka pagrindinį vaidmenį formuojant T ląstelių funkcionavimą ir išlaikant jų pusiausvyrą. Visi jie yra tame pačiame DNR ruože, koduojančiame baltymus, kurių tiksliai suderinta koordinacija yra būtina imuninei sveikatai.
Nors mokslininkai jau seniai pripažino gyvybiškai svarbią šių gretimų genų funkciją, daug mažiau žinoma apie tai, kaip jie įjungiami ir išjungiami specializuotose T ląstelėse, kurios slopina imuninę sistemą. Taip pat trūksta žinių apie tai, kaip jungikliai veikia, kai T ląstelės yra ramybės būsenoje, o ne stimuliuojamos.
Naujame tyrime Gladstone instituto mokslininkai naudojo įrankį, žinomą kaip CRISPR trukdžiai arba CRISPRi, kad nustatytų sluoksniuotus mechanizmus, kontroliuojančius šių pagrindinių imuninių genų ekspresiją. Išvados, paskelbtos m Gamtos genetikasuteikia vertingų įžvalgų apie imuninę pusiausvyrą, autoimunines ligas ir vėžio imunoterapijos raidą.
„Iki neseniai mums trūko įrankių, leidžiančių sistemingai nustatyti mechaninius ryšius, kuriais grindžiamas koordinuotas genų, sugrupuotų kaip kaimynai vienoje genomo vietoje, reguliavimas“, – sako Gladstone'o vyresnysis tyrėjas Alexas Marsonas, MD, Ph.D., Gladstone- direktorius. UCSF Genominės imunologijos institutas, kuris vadovavo tyrimui.
„Dabar mes galime pradėti iššifruoti sudėtingą daugelio genų vietos, susijusios su ligos rizika, logiką, ir mes galime tai padaryti tiesiogiai žmogaus ląstelėse, kurios atlieka pagrindinį vaidmenį tose ligose.”
Tokios žinios yra labai svarbios norint suprasti imuninės sistemos sąlygotų sąlygų pagrindą. Pavyzdžiui, asmens rizika susirgti tam tikromis autoimuninėmis ligomis gali būti susijusi su genetiniais variantais toje pačioje DNR „kaimynystėje“, turinčiais įtakos jungikliams, kontroliuojantiems tris imuninius genus. Ir tai padės kurti naujas vėžio imunoterapijas, kurios nurodo žmogaus T ląstelėms kovoti su vėžinėmis ląstelėmis, sako Marsonas.
Atrakinkite naują supratimo lygį
Cody Mowery, MD-Ph. kandidatas Marsono laboratorijoje ir Kalifornijos universitete San Franciske, daugiausia dėmesio skiriant DNR ruožui, kuriame yra CD28, CTLA4 ir ICOS, buvo nieko gero. Yra žinoma, kad šio lokuso variantai yra susiję su autoimuniniais sutrikimais, tokiais kaip vilkligė ir uždegiminė žarnyno liga, o kai kurie gydymo būdai, nukreipti į šiuos genus, jau yra, pagerinantys ir prailginantys žmonių, sergančių autoimuninėmis ligomis ir vėžiu, gyvenimą.
„Nemanau, kad įmanoma pervertinti šių genų svarbą“, – sako pirmasis naujojo tyrimo autorius Mowery. „Ir atsižvelgiant į tai, kad jie tiesiog guli vienas šalia kito genome, žinoma, norime įsitraukti ir suprasti viską, ką galime“.
Pagrindinės genų ekspresijos kontrolės priemonės yra gerai žinomos. Kai kurie pagrindiniai veikėjai yra CRE, trumpinys „cis-reguliavimo elementai“. CRE yra nekoduojantys DNR ruožai, esantys šalia jų reguliuojamo geno. CRE taip pat sąveikauja su kitais reguliavimo elementais, žinomais kaip transreguliatoriai, kad sustiprintų arba sustabdytų DNR transkripciją – pirmąjį genų į baltymą gamybos linijos žingsnį.
Gladstone'o mokslininkai norėjo atrasti CRE vietą ir išbandyti specifinių CRE vaidmenį reguliuojant tris genus, o tai galėtų suteikti informacijos apie pagrindines ligos rizikos priežastis.
„Atsižvelgiant į tam tikrą ląstelių tipą ir dabartinę jos aktyvacijos būseną, norėjome sužinoti, kas lemia vieno geno ekspresiją, o kito slopinimą toje pačioje situacijoje“, – sako Mowery. „Atsakymas į šį klausimą tampa labai sudėtingas, kai turite labai suderintą genų reguliavimą tame pačiame lokuse.”
Tyrimo grupė naudojo CRISPRi, kad sutrikdytų daugiau nei 11 500 tikslinių vietų – kiekviena skirtingoje žmogaus T ląstelėje – visame DNR ruože, kuriame yra CD28, CTLA4 ir ICOS. Jie tai padarė dviejų skirtingų tipų T ląstelėse iš žmogaus kraujo donorų, tada ištyrė poveikį genų ekspresijai.
„Tai nebūtų buvę įmanoma, kol mūsų grupė neseniai sukūrė metodus, kaip CRISPRi pritaikyti pirminėse žmogaus T ląstelėse“, – sako Jimmie Ye, Ph.D., Gladstone'o tyrėjas ir San Francisko universiteto medicinos profesorius. Kartu su Marsonu jis buvo vienas iš vyresniųjų tyrimo autorių.
Grupės analizė, kurią padėjo Gladstone vyresniosios tyrėjos Katie Pollard, Ph.D. skaičiavimo biologijos laboratorija, nustatė ir nustatė specifinių CRE poveikį kiekvieno iš trijų genų ekspresijai esant skirtingoms ląstelių aktyvavimo būsenoms.
Jie nustatė, kad kai kuriais atvejais konkretaus geno ekspresiją kontroliuoja skirtingi CRE, priklausomai nuo ląstelės tipo arba aktyvacijos būsenos. Kai kurie CRE yra bendrinami tarp genų, bet veikia kiekvieną geną skirtingai, o CRE, turintis įtakos geno ekspresijai, gali būti toli nuo paties geno.
„Šio proceso metu mes galėjome patvirtinti specifinių CRE funkcinį poveikį, kuris anksčiau buvo tik netiesiogiai susijęs su genų ekspresija“, – sako Ye.
Daugiasluoksnis sudėtingumas
Tada mokslininkai įtraukė anksčiau sudarytus duomenų rinkinius ir papildomus molekulinius bei skaičiavimo įrankius, kad nustatytų trijų genų transreguliatorius ir susietų juos su konkrečiais CRE, kuriuos jie veikia. Analizė taip pat atskleidė galimus reguliavimo kryžminimo mechanizmus tarp genų ir genetinio regiono vietų, kurios, atrodo, formuoja 3D DNR architektūrą, kad įsitikintų, jog jungikliai sutelkia savo veiklą į teisingus genų taikinius.
„Dabar mes turime daug dinamiškesnį genų reguliavimo vaizdą šiame lokuse“, – sako Marsonas, kuris taip pat yra Parkerio vėžio imunoterapijos instituto Gladstone institutuose direktorius. „Šis naujas supratimo lygis ilgainiui gali paskatinti geresnius autoimuninių ligų ir vėžio gydymo būdus.”
Komanda jau parodė vieną galimą pavyzdį: Nustatyti CRE, jie atskleidė du genetinius variantus, kurie, atrodo, stipriai veikia CTLA4 ekspresiją ir yra susiję su reumatoidiniu artritu. Tolesni tyrimai gali atskleisti jų galimą klinikinę reikšmę.
Mokslininkai taip pat domisi savo tyrimų pasekmėmis genomo inžinerijai gydyti ligas.
„Daug dėmesio skiriama genų inžinerijos naudojimui, siekiant sukurti naujus baltymus ląstelėse“, – sako Ye. „Bet aš manau, kad ateityje visa reguliavimo logika bus sujungta į nekoduojančias baltymų sekas taip, kad galėtume atlikti daug geresnę kontrolę.”