Smegenų sutrikimai, tokie kaip Parkinsono liga (PD) arba Alzheimerio liga (AD), pacientams pradeda vystytis daug anksčiau nei tada, kai atsiranda pirmieji klinikiniai simptomai. Gydant pacientus šiose ankstyvosiose stadijose galima sulėtinti ar net sustabdyti jų ligą, tačiau šiuo metu nėra būdo diagnozuoti smegenų sutrikimus tose ikisimptominėse stadijose. Iki šiol, pavyzdžiui, specifinius smegenų pažeidimus, kuriuos sukelia PD, galima aptikti tik analizuojant smegenų biopsijas, kurias galima gauti tik po mirties.
Norėdami įveikti šią kritinę kliūtį, mokslininkai siekė naujos „skysčių biopsijos“ koncepcijos, kuri apima lengvą kraujo ar kitų kūno skysčių ištraukimą naudojant neinvazines procedūras ir analizę, ar nėra molekulių, kilusių iš smegenų ir kitų kietų audinių.
Ypač daug žadantis taikinys kūno skysčiuose yra „ekstraląstelinės pūslelės“ (EV), mažyčiai su membranomis susieti maišeliai, kuriuos smegenys ir kitos ląstelės išskiria į aplinkinius skysčius. Šiuose maišeliuose yra įvairių molekulių, kurios gali būti unikalios jas gaminančių ląstelių tipams, pvz., smegenims, ir todėl gali turėti apsaugotus biologinius žymenis ankstyvai Parkinsono ir kitų smegenų ligų atsiradimui.
Tačiau, nepaisant pastarojo meto pažangos, EV ekspertai nesugebėjo išspręsti problemos, ar tam tikros biologinių žymenų molekulės, kurias jie išmatavo izoliuotuose EV, yra griežtai EV viduje, ar nespecifiškai susietos su jų paviršiumi. Šis iššūkis iš tikrųjų neleido jiems padaryti nedviprasmiškų išvadų apie krovinių molekules EV iš visų tipų audinių.
Dabar bendradarbiaujanti komanda, vadovaujama daktaro Davido Walto. Harvardo universiteto Wyss institute ir Bostono Brighamo ir moterų ligoninėje (BWH) šią problemą išsprendė pridėdama esminį žingsnį prie jau patvirtinto itin jautraus protokolo. Fermentiškai virškindami visus su paviršiumi susietus baltymus iš išgrynintos EV populiacijos, jie sugebėjo specialiai patekti į EV viduje apsaugotus krovinius, pašalindami nespecifinius „užteršimus“.
Naudodami patobulintą protokolą PD biomarkerio ⍺-sinukleino kiekiui kraujyje matuoti, jie pirmą kartą sugebėjo tiksliai nustatyti nedidelę bet kurio baltymo, esančio EV, dalį, palyginti su jo laisvu kiekiu bendroje kraujo plazmoje.
Svarbu tai, kad jie integravo šį pažangą su naujai sukurtu itin jautriu ⍺-sinukleino formos aptikimo tyrimu, kuris vis labiau fosforilinamas progresuojant PD ir susijusiai būklei Lewy kūno demencija. Analizuojant pacientų mėginių grupę, jie galėjo aptikti patologinio ⍺-sinukleino baltymo praturtėjimą EV viduje, palyginti su visa plazma. Išvados paskelbtos m Nacionalinės mokslų akademijos darbai.
„Per pastaruosius kelis dešimtmečius mūsų ir kitose grupėse atliekami EV tyrimai nuolat gerino mūsų supratimą apie jų sudėtingą biologiją ir molekulinę sudėtį. Tačiau grynų audinių specifinių EV išskyrimas nuo kūno skysčių, tokių kaip kraujas ar centrinę nervų sistemą supantis smegenų skystis. sistema, įskaitant smegenis, ir tikrojo jų turinio patvirtinimas bei kiekybinis įvertinimas tiksliais matavimais vis dar kelia didžiulių techninių iššūkių“, – sakė Wyss pagrindinio fakulteto narys Waltas.
„Mūsų pastaruoju metu atliktas darbas yra sprendimas, padėsiantis užpildyti šią technologinę spragą ir priartėti prie galimybės gauti EV neužterštos, kad galėtume juos naudoti kaip turtingus klinikinių biologinių žymenų šaltinius, kaip rodome fosforilinto ⍺- sinukleinas“.
Waltas, kuris yra Wyss instituto diagnostikos greitintuvo vadovas, taip pat yra Hansjörg Wyss biologiškai įkvėptos inžinerijos profesorius Harvardo medicinos mokykloje (HMS), patologijos profesorius Brigham ir moterų ligoninėje ir Howardo Hugheso medicinos instituto profesorius.
Nuo kraujo iki EV iki biomarkerių iki diagnozės
Ypač motyvuota diagnostinių elektromobilių pažadų anksti diagnozuoti PD, AD ir kitus smegenų sutrikimus, Walto grupė sistemingai pildė svarbias dalis į šią techninę dėlionę. Anksčiau jie sukūrė techninę EV kiekybinio nustatymo sistemą ir panaudojo šį kiekybinį įvertinimą, kad palygintų EV išskyrimo iš kūno skysčių metodus.
Jų metodika apjungia atskyrimo metodą, žinomą kaip dydžio išskyrimo chromatografija (SEC), kad atgautų daugumą EV iš biofluidų naudojant itin jautrius „Simoa tyrimus“, leidžiančius suskaičiuoti atskiras baltymo molekules, susijusias su EV, kurias jie užfiksavo ir vizualizavo naudodami specifinius antikūnus. Iki šiol komanda sukūrė Simoa tyrimus įvairiems EV specifiniams biomarkeriams ir, svarbiausia, išskyrė plačiai naudojamą paviršiaus baltymą L1CAM kaip tikslą išskirti smegenims būdingus EV, o tai suteikė laukui svarbią kurso korekciją. .
„Norėdami atsakyti į konceptualiai paprastą, bet techniškai sudėtingą klausimą, kiek procentų tam tikro baltymo (pvz., ⍺-sinukleino) yra EV viduje, palyginti su išorėje, naudojome SEC išskyrimo metodus, kuriuos anksčiau sukūrėme, kad išskirtume daugumą EV nuo plazmos. kartu su optimizuotu „proteinazės apsaugos tyrimu“, kai naudojame fermentą, kad švelniai, bet efektyviai sukramtytume visus baltymus nuo izoliuotų elektrinių transporto priemonių paviršiaus, o membrana uždarytas EV vidus nepaliestų“, – sakė vienas iš pirmųjų autorių Dima Ter-Ovanesyanas, Ph. .D., kuris yra Wyss instituto vyresnysis mokslininkas ir vadovauja EV projektui kartu su pirmuoju autoriumi ir doktorantūros mokslų daktaru Tal Gilboa.
Be to, norėdami išmatuoti labai žemą ⍺-sinukleino kiekį, Gilboa kartu su doktorantūra Gina Wang, Ph.D. ir Wyss tyrimų asistentė Sara Whiteman Walt laboratorijoje sukūrė Simoa tyrimą ⍺-sinukleinui, kuris yra daug jautresnis nei bet kuris anksčiau aprašytas tyrimas. Naudodama šį tyrimą savo protokole, komanda sugebėjo nustatyti, kad dauguma ⍺-sinukleino EV, išskirtuose naudojant SEC protokolą, buvo apsaugoti ir kad šis kiekis sudaro mažiau nei 5% viso kraujo plazmos ⍺-sinukleino.
Šio kiekio supratimas yra ypač svarbus siekiant galutinio tikslo išmatuoti ⍺-sinukleiną iš neuronų gautuose EV, nes tikimasi, kad EV, kilę iš konkretaus audinio, pavyzdžiui, smegenų, bus reti, palyginti su EV iš kraujo ląstelių, kur taip pat yra išreikštas ⍺-sinukleinas. .
Svarbu tai, kad be itin jautraus Simoa tyrimo, kuris leido aptikti normalų nemodifikuotą ⍺-sinukleino baltymą, jie taip pat sukūrė tyrimą, galintį aptikti ⍺-sinukleiną, kuris kurso metu fosforilinamas konkrečioje vietoje (pSer129). PD progresavimo.
„Kai pritaikėme savo pažangią metodiką kraujo mėginių grupei, paimtam iš pacientų, sergančių PD ir Lewy kūno demencija, taip pat sveikų kontrolinių donorų, nustatėme, kad fosforilinto ⍺-sinukleino ir bendro ⍺-sinukleino santykis buvo nuo dviejų iki trijų. kartus didesnis EV viduje, palyginti su EV išorėje“, – sakė Gilboa.
„Tai buvo labai įdomu, nes tai rodo, kad EV gali apsaugoti baltymų fosforilinimo būseną nuo cirkuliuojančių fosfatazių, kurios kitu atveju ištrintų šį labai informatyvų ženklą.
Grupė dabar toliau tiria, ar šie tyrimai galėtų būti naudojami atskirti PD pacientus nuo žmonių, nesergančių šia liga.
„Davido Walto komandos darbas pristato technologinę pažangą, kuri priartina mus prie naujos kartos diagnostikos platformos, turinčios nepaprastą potencialą. Šiuo metu mes dar toli nuo šių itin turtingų ir daug pasakančių ląstelių gautų įrenginių naudojimo. pūslelės, kaip langas, leidžiantis patekti į pacientų smegenis nereikalaujant operacijos“, – sakė Wyss įkūrėjas Donaldas Ingberis, medicinos mokslų daktaras, Judah Folkmanas kraujagyslių biologijos profesorius HMS ir Bostono vaikų ligoninėje bei Hansjörg Wyss. Biologiškai įkvėptos inžinerijos profesorius Harvardo John A. Paulson inžinerijos ir taikomųjų mokslų mokykloje.
Papildomi šio straipsnio autoriai yra George Church, Ph.D., Wyss pagrindinio fakulteto narys ir Robert Winthrop genetikos profesorius HMS ir Alice Chen-Plotkin, MD, Parker šeimos neurologijos profesorė Perelmano medicinos mokykloje Pensilvanijos universitetas, Filadelfija, kurie abu bendradarbiavo su Walto grupe nuo pat EV projekto pradžios, taip pat George'as Kannarkat.